isoCell是英國(guó)iotaSciences公司推出的一款基于GRID專li技術(shù)（專li號(hào)：WO2019197373A1）、高通量、高自動(dòng)化的單細(xì)胞可視化分選培養(yǎng)系統(tǒng)。isoCell采用微射流技術(shù)，利用界面張力對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基（或干細(xì)胞涂層）進(jìn)行重塑，在培養(yǎng)皿上雕刻出單獨(dú)的細(xì)胞腔室GRID（可以在6厘米培養(yǎng)皿上創(chuàng)建256個(gè)單細(xì)胞腔室GRID陣列），并將細(xì)胞以納升體積全自動(dòng)地分配到各個(gè)GRID單細(xì)胞腔室中。isoCell可以避免邊界效應(yīng)，利用其自帶的光學(xué)顯微鏡可以清楚地看到GRID室中的單細(xì)胞，以確保isoCell分選出的細(xì)胞100%為單細(xì)胞。isoCell可以將單細(xì)胞在GRID中培養(yǎng)成單克隆細(xì)胞系，培養(yǎng)過(guò)程中可以根據(jù)客戶需求進(jìn)行換液操作，全流程可視化監(jiān)控以保證每個(gè)單克隆細(xì)胞系均來(lái)自所挑選的單個(gè)細(xì)胞。

      通過(guò)isoCell單細(xì)胞可視化分選培養(yǎng)系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化、高成活率的單克隆細(xì)胞系構(gòu)建、微生物分選與培養(yǎng)、單細(xì)胞分選、單細(xì)胞組學(xué)等功能。

應(yīng)用領(lǐng)域

設(shè)備特點(diǎn)

      - 全自動(dòng)化流程

      - 操作條件溫和，對(duì)單細(xì)胞無(wú)損傷

      - 全培養(yǎng)、分析流程可視化追蹤

      - 單細(xì)胞分離效率高達(dá)100%

      - 單克隆細(xì)胞系構(gòu)建成活率高

      - 直接轉(zhuǎn)移到PCR管或96孔板

      - 結(jié)構(gòu)緊湊，體積小

      傳統(tǒng)單細(xì)胞分離手段無(wú)法保證所得的樣品內(nèi)100%只有一個(gè)單細(xì)胞，可能有多個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)，導(dǎo)致下游的實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)誤差。且傳統(tǒng)構(gòu)建單克隆細(xì)胞系技術(shù)受限于單細(xì)胞的高度敏感性，成功率較低，也無(wú)法保證每一個(gè)單克隆細(xì)胞系均來(lái)自單個(gè)細(xì)胞。isoCell采用的GRID單細(xì)胞腔室技術(shù)，可以保證100%準(zhǔn)確的單細(xì)胞分選，并在GRID中高度自動(dòng)化地直接培育單克隆細(xì)胞系，成活率高達(dá)60%以上，且通過(guò)全流程可視化監(jiān)控，保證每一個(gè)單克隆細(xì)胞系均來(lái)自于挑選的單個(gè)細(xì)胞。isoCell分選、培養(yǎng)條件溫和，可以顯著提高單細(xì)胞克隆的存活率。同時(shí)isoCell可以將單細(xì)胞樣品按照特定的體積直接轉(zhuǎn)移到96孔板或PCR管中，無(wú)縫銜接單細(xì)胞下游應(yīng)用，確保后續(xù)單細(xì)胞組學(xué)信息完整性。

應(yīng)用案例

人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSCs)的單細(xì)胞克隆

      人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSCs)構(gòu)建單克隆細(xì)胞系培養(yǎng)步驟繁瑣，細(xì)胞對(duì)異常的處理和操作非常敏感，傳統(tǒng)單細(xì)胞分選容易導(dǎo)致細(xì)胞和遺傳毒性應(yīng)激的積累，進(jìn)而導(dǎo)致不良分化和多能性喪失。

      使用isoCell可以溫和且自動(dòng)化地將人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSCs)進(jìn)行單細(xì)胞分選并進(jìn)行培養(yǎng)，高效地培養(yǎng)hiPSCs單克隆細(xì)胞系，顯著提高了細(xì)胞分離與克隆效率（如下圖所示）。

K562細(xì)胞單細(xì)胞測(cè)序

      傳統(tǒng)單細(xì)胞測(cè)序需對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增（WGA），但傳統(tǒng)單細(xì)胞WGA受限于如何獲得單個(gè)細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到小體積的WGA反應(yīng)中。

      使用isoCell自動(dòng)將K562細(xì)胞拾取并轉(zhuǎn)移至含3.5 µl scWGA試劑的PCR管中，并無(wú)縫銜接scWGA反應(yīng)。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示（下圖），單細(xì)胞WGA的DNA樣本(+)中兩種基因均被特異性擴(kuò)增，而陰性對(duì)照(-)沒(méi)有這兩種擴(kuò)增產(chǎn)物，符合預(yù)期。

對(duì)人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (hiPSCs) Prime 編輯構(gòu)建工程細(xì)胞系

      Prime 編輯可在 HEK3 基因座中高效精確插入三個(gè)核苷酸，用于構(gòu)建工程細(xì)胞系hiPSCs。通過(guò)引入靶標(biāo)特異性 pegRNA 來(lái)編輯單個(gè)或多個(gè)基因組位點(diǎn)，以進(jìn)行精確有效的基因組編輯，促進(jìn)疾病建模和功能遺傳學(xué)研究。

      Prime 編輯使用與逆轉(zhuǎn)錄酶融合的 Cas9 切口酶，將 DNA 序列從“Prime 編輯"引導(dǎo) RNA (pegRNA) 復(fù)制到特定基因座。通過(guò)Prime 編輯將多西環(huán)素誘導(dǎo)型 Prime Editor 蛋白 (PE2) 整合到 iPSC 細(xì)胞系的AAVS1 基因組，之后使用isoCell分選轉(zhuǎn)入靶基因的hiPSCs細(xì)胞系，以確保細(xì)胞的單克隆性。（見(jiàn)上圖）

      該研究使用isoCell來(lái)確保工程細(xì)胞系的單克隆性與準(zhǔn)確性。

參考文獻(xiàn)：Bharucha N, Ataam J A, Gavidia A A, et al. Generation of AAVS1 integrated doxycycline-inducible CRISPR-Prime Editor human induced pluripotent stem cell line[J]. Stem Cell Research, 2021, 57: 102610.

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）通過(guò)表觀遺傳免疫編輯獲得骨髓相關(guān)轉(zhuǎn)錄程序以引發(fā)免疫逃逸

      研究人員通過(guò)將多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞 (GSC) 連續(xù)移植到免疫活性宿主中，發(fā)現(xiàn) GSC 通過(guò)建立增強(qiáng)的免疫抑制腫瘤微環(huán)境來(lái)免疫逃逸。從機(jī)制上講，GSC通過(guò)表觀遺傳免疫編輯過(guò)程引起，其在免疫攻擊后強(qiáng)制執(zhí)行 GSC 中穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳變化。研究中使用Irf8敲除細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)證明，Irf8的激活是細(xì)胞免疫逃逸的一個(gè)重要因素，且在體內(nèi)可能通過(guò)IFNγ介導(dǎo)的激活發(fā)生。該研究使用isoCell構(gòu)建Irf8克隆敲除系。

參考文獻(xiàn)：Gangoso E, Southgate B, Bradley L, et al. Glioblastomas acquire myeloid-affiliated transcriptional programs via epigenetic immunoediting to elicit immune evasion[J]. Cell, 2021, 184(9): 2454-2470. e26.

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