瑞士Cytosurge公司的多功能單細胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM BOT，是將原子力系統(tǒng)、微流控系統(tǒng)、納米位移臺系統(tǒng)合為體的單細胞操作系統(tǒng)，能夠在單細胞水平上為研究者提供很大的便，可應用于單細胞力譜、單細胞質譜、單細胞基因編輯、細胞系構建、藥物研發(fā)、醫(yī)療等域。本文將從單細胞實驗方法和多功能單細胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM BOT結構出發(fā)，詳細介紹多功能單細胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM BOT在單細胞力學實驗中的應用。

. 單細胞實驗方法簡介

       在細胞生物學實驗中，由于細胞的異質性，每個細胞互相之間都存在定差異，因此在單細胞層面研究細胞性質可以獲得更加準確的結果。近年來，多種單細胞研究技術不斷涌現，應用于醫(yī)學診斷、組織工程和藥物篩選等域。

       對于細胞力學測定，原子力顯微鏡（AFM）能夠對單個細胞或生物分子進行高分辨成像和力譜測定，但是細胞與探針的結合過程不可逆，無法實現連續(xù)、快速的檢測。

       對于細胞分離/分選技術，可選的有玻璃細管、光鑷、流式細胞分選和磁珠分選等方法，然而有的從表面分離細胞時容易損傷細胞，有的無法從同類細胞群中分離出單個細胞。

       對于細胞注射與提取，可選用納米噴泉探針、納米針和碳納米管等，然而這些方法無法實現飛升以下量的含量注射，且注射時間較長。

       多功能單細胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM BOT，針對細胞力學測量、分離/分選、注射與提取等應用，在結合以上技術的勢的同時克服了這些技術固有的問題，是套多功能的單細胞研究系統(tǒng)，在單細胞研究域發(fā)揮著巨大作用。

二. 多功能單細胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM BOT結構

       簡單來說，多功能單細胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM BOT是AFM與微流控的結合，主要由AFM掃描頭、壓力控制器與微流控探針組成（圖1）。AFM掃描頭裝載于倒置顯微鏡上，整體結構大致與普通AFM相同，主要區(qū)別是探針中間有微流通道，后端連接液體池，前端探針有小孔，用于液體的流入流出。微流通道內徑小于細胞，防止細胞進入堵塞；探針則有多種不同孔徑和不同的彈性，可根據不同應用以及不同樣本更換所需探針。

圖1 FluidFM BOT系統(tǒng)圖示。（a）微流控系統(tǒng)與AFM的結合應用；（b）（c）（d）探針的殊設計。

三. 單細胞力學應用

       傳統(tǒng)AFM用于單細胞力學測量時，需要對探針進行定處理以粘附細胞，后再與需要和細胞相互作用的表面、分子或其他細胞相結合，有時會產生多個細胞粘附，且反復測力會導致細胞被破壞，使得每次測量都必須準備新的探針，實驗效率較低。

       多功能單細胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM BOT通過將AFM與微流控相結合，使單細胞力學實驗更高效，更簡潔。對于已經結合在表面的固定細胞，可根據細胞尺寸安裝適用的探針，從上方接觸需要測量的細胞，通過微流控系統(tǒng)施加負壓吸起細胞，獲得力-距離曲線；也可以吸取懸浮細胞，與表面或其他固定細胞接觸后，測量力-距離關系。這種方法能夠提供遠比蛋白結合牢固的多的吸附力，能夠將細胞牢固的固定在探針上面，因此能夠用于直接從基質上分離；另方面，由于沒有生物處理，這種方法不會改變任何細胞表面的通路，從而能夠得到接近細胞原生的數據。

       單個細胞測量完成后可移動探針至細胞板其他孔內，施加正壓將其釋放，再回到實驗孔吸取下個細胞，意味著單個探針可以進行多次測量。

       細胞粘附是許多生理過程的重要步驟，細胞粘附力的測定可以為組織形態(tài)發(fā)生、胚胎發(fā)育、腫瘤、免疫反應和微生物膜等研究提供重要信息。多功能單細胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM BOT支持真核和原核細胞與細胞板/培養(yǎng)皿表面、抗菌/粘性/抗體包被的表面或其他細胞的粘附力測量（圖2）。

圖2 不同細胞在不同環(huán)境下的粘附力-距離曲線。（a）探針接近、暫停、吸取并拉伸細胞的過程中探針偏轉隨時間的變化；（b）Hela細胞與纖連蛋白包被的表面的粘附力-距離曲線；（c）不同接觸時間下大腸桿菌與PLL表面的粘附力-距離曲線；（d）大腸桿菌與PLL表面的分離距離與接觸時間的關系；（e）釀膿鏈球菌與玻璃表面的粘附力-距離曲線，表示多個球菌的連續(xù)分離；（f）單個細胞與單細胞層的粘附力-距離曲線。

       Sankaran等人^[1]使用多功能單細胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM BOT來研究在共價和非共價的表面整合素受體對細胞粘附力的影響。通過測定發(fā)現兩者均可有效增加細胞的粘附能力，并且效果近似（圖3）。

圖3使用FluidFM BOT測定共價鍵與非共價鍵的整合素受體之間RGD的區(qū)別。（a）實驗示意圖；（b）粘附力測定前后示意圖；（c）粘附力-距離曲線；（d）大粘附力。

       多功能單細胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM BOT還可用于測量細胞的應力以研究細胞骨架的性質。Sancho等人^[2]將10μm的小膠球吸附于探針上，之后使用探針去壓細胞直到探針壓力達到2 nN，通過壓痕曲線來分析細胞骨架變化。通過對比發(fā)現過量表達MSX1的細胞硬度顯著高于普通細胞（圖4）。

圖4 使用FluidFM BOT測定HUAEC中MSX1過表達對細胞骨架的影響。（d）實驗示意圖；（e）吸附10μm珠子；（f）下壓時空白細胞的力學譜線；（g）下壓時MSX1過表達細胞的力學譜線，凹陷更深、斜率更高，表示其剛度相對更高；（h）膠體壓痕法的測量結果。

四. 其他應用

       多功能單細胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM BOT可用于細胞內注射與提?。▓D3），通過力學測量，可以控制探針刺入細胞質或細胞核內進行飛升別含量的液體注射或提取。此外，FluidFM BOT系統(tǒng)還可用于細胞分離以及細胞延展性研究。

圖5 FluidFM BOT系統(tǒng)的細胞內注射過程。（a）探針對準細胞；（b）探針刺破細胞膜，注入含熒光染料的目標液體；（c）探針與細胞分離，注射完成。

       多功能單細胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM BOT克服了現有單細胞技術的短板，將多種單細胞應用相結合，高通量、高效率地獲取單細胞層面的詳細數據，研究多種細胞性質，尤其適合應用于醫(yī)療、單細胞生物學、單細胞質譜、單細胞基因編輯、藥物研發(fā)等域。

參考文獻：

[1]. Cell Adhesion on Dynamic Supramolecular Surfaces Probed by Fluid Force Microscopy-Based Single-Cell Force Spectroscopy, ACS Nano 2017, 11, 4, 3867–3874.

[2]. A new strategy to measure intercellular adhesion forces in mature cell-cell contacts. Sci Rep 7, 46152 (2017).